На правах рукописи - страница 2

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 217 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав с описанием методики и результатов исследова­ния, заключения, выводов, библиографии (104 источников на русском и 137 на иностранном языках) и приложений. Работа содержит 30 рисунков и 28 таблиц.
^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для реализации поставленной цели было проведено многоплановое комплексное исследование, в котором были использованы клинические, биохимические, молекулярно-генетические, генеалогические, психологические, статистические методы.

Нами обобщенны данные о группах пациентов, которые послужили информационной базой исследования:

Программа неонатального скрининга обязательно включает в себя следующие этапы: 1) взятие биологического материала для исследования у всех новорожденных и доставка материала в диагностическую лабораторию; 2) лабораторная просеивающая диагностика; 3) уточняющая диагностика всех случаев с положительными результатами при просеивании; 4) лечение больных и их диспансеризация с контролем за ходом лечения; 5) медико-генетическое консультирование семьи.

Материалом для исследования служила капиллярная кровь, взятая в родильном доме из пальца или пятки новорожденного на 4-5-й день жизни на бланки фильтровальной бумаги марки Schleicher & Schuell 2992. Высушенные образцы крови отсылались в лабораторию КММГК письмом или передавались с нарочным. Определение метаболитов проводилось в качественно взятых образцах крови. При повышенном уровне исследуемых метаболитов проводилось повторное исследование в дублях в образцах крови поступивших тест-бланков. Если среднее число 3-х результатов было выше порогового уровня, проводился забор крови для повторного исследования (ретест). При положительном ретесте дети срочно вызывались в МГК для проведения подтверждающей диагностики. Накопление и обработка данных проводилась с использованием разработанной в КММГК компьютерной программы «Скрининг новорожденных».

С целью диагностики фенилкетонурии определяли уровень фенилаланина (ФА). До 1992г. использовался полуколичественный микробиологический тест Гатри, с 1992г. - количественный флюориметрический метод. Пороговым значением считали уровень ФА более 2,0мг/дл. Если при проведении подтверждающей диагностики уровень ФА определялся более 7,9мг/дл, диагностировалась Фенилкетонурия и назначалась терапия. При ФА от 2,1 до 7,9мг/дл ставился диагноз «Доброкачественная гиперфенилаланинемия».

С целью диагностики врожденного гипотиреоза определяли уровень тиреотропного гормона (ТТГ) методом иммунофлюоресцентного анализа с временным разрешением люминесценции. Пороговым значением для выявления ВГ считали уровень ТТГ≥20 мЕ/л у новорожденных 4-5 дней жизни, ТТГ≥5 мЕ/л у новорожденных 7-14 дней жизни. Подтверждающая диагностика проводилась методом иммунофлюоресцентного анализа в сыворотке крови путем определения ТТГ, свободного тироксина (св.Т4).

С целью диагностики муковисцидоза определяли уровень иммунореактивного трипсина (ИРТ) иммунофлюоресцентным методом. При положительном результате скрининга (ИРТ >70 нг/мл) проводили повторное определение ИРТ в образцах крови, собранных на 21-28-й день жизни. При повторно высоком уровне ИРТ (>40 нг/мл) проводили потовую пробу с помощью системы для электрофореза и сбора пота Macroduct корпорации “Vescor”. Измерялась “эквивалентная” концентрация хлорида натрия в потовой жидкости. За норму принимались результаты 0-60 ммоль/л, показатели 60-80 ммоль/л расценивались как пограничные, 80 ммоль/л и выше считались позитивными для муковисцидоза. При пограничном и позитивном результате потовой пробы проводили ДНК-диагностику.

С целью диагностики адреногенитального синдрома определяли уровень 17α-оксигидропрогестерона (17-ОНР) методом твердофазного иммунофлюоресцентного анализа с временным разрешением люминесценции. За пороговый уровень у доношенных новорожденных (срок гестации больше 36 недель, вес больше 2,5кг) принимали значения 17-ОНР 30,0 nmol/l, у недоношенных при сроке гестации 33-36 недель (вес меньше 2,5кг) – 60,0 nmol/l, при сроке гестации 23-32 недели - 100,0 nmol/l.

Подтверждающая диагностика проводилась путем ультразвукового исследования надпочечников и определения в крови уровня электролитов (калий, натрий), кортизола, 17-ОНР.

С целью диагностики галактоземии определяли уровень общей галактозы (Гал) (галактоза + галактоза-1-фосфаты) флюоресцентным методом. Пороговым значением для выявления галактоземии считали уровень Гал >7,1 мг/дл.

В качестве материала для молекулярно-генетических исследований использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов цельной крови или пятен высушенной крови на фильтрах, с последующей амплификацией, анализом расщепления фрагментов ДНК ферментами рестрикции, детекцией на электрофорезе фрагментов ДНК в полиакриламидных гелях.

Для определения мутаций использовали наборы, разработанные в ГУ МГНЦ РАМН:

«PCU-8» - для определения 8 частых мутаций в гене ФАГ (I65T, IVS10nt546, IVS12nt1, R261Q, R252W, R408W, R158Q, P281L);

«CF-9» и «CF-5» - для диагностики 9 и 5 мутаций соответственно в гене CFTR (del21kb, delF508, delI507, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X; W1282X, N1303K, L138ins, R334W, 3849+10kbc->T).

Полученные результаты документировали с помощью программного обеспечения «Gel Imager» (Россия).

Генетико-эпидемиологические исследования проводились с использованием данных неонатального скрининга за период 1987-2007 гг. В ходе работы созданы компьютерные базы данных семей: с ФКУ (230 случаев ФКУ из 205 семей), с ВГ (170 случаев ВГ из 168 семей), с АГС (15 семей), МВ (10 семей), ГАЛ (6 семей). Полученные данные сравнивали с официальными демографическими данными по Краснодарскому краю (Основные итоги Всероссийской переписи населения 2002г. по Краснодарскому краю, 2003г.).

Были проанализированы амбулаторные медико-генетические карты, разработанные нами анкеты на семьи с больными НБО.

Частоту гетерозиготных носителей фенилкетонурии в популяции рассчитывали на основании закона Харди-Вайнберга по формуле:

p2+2pq+q2=1,

где q - частота нормального гена,

p - частота мутантного аллеля.

Изучение интеллектуального уровня детей с ФКУ дошкольного возраста проводилось рисуночным тестом Гудиноф-Харриса, школьного возраста - с помощью компьютерной программы “Тест”, которая является адаптированным вариантом теста Д.Векслера. Определяли коэффициент интеллекта ОИП (общий интеллектуальный потенциал). За минимальное значение нормы принимали коэффициент ОИП =70. При подозрении на снижение интеллекта (ОИП=70 и ниже) ребенок консультировался детским психиатром.

Для диагностики психического развития детей с ФКУ применялись методы наблюдения и стандартные патопсихологические методики, адаптированные для каждого возрастного интервала.

Для оценки физического развития детей определяли массо-ростовой индекс (МРИ) по формуле:

МРИ =

М х 100

P

где М - отношение фактической массы тела к величине 50-го перцентиля этого показателя для данного возраста,

P - отношение фактической длины тела к величине 50-го перцентиля этого показателя для данного возраста.

За норму принимали МРИ от 90 до 99. При МРИ=89 и ниже диагностировали дефицит массы тела, при МРИ=100 и более - избыточную массу тела.

Результаты исследования обработаны методами вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990; Кайданов Л.З., 1996) с определением критерия Стьюдента, средней арифметической (М), стандартной ошибки (m) и показателя достоверности различий (р).

^ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Организация неонатального скрининга на наследственные болезни обмена в Краснодарском крае

Началом неонатального скрининга на НБО принято считать 1962г., когда в штате Массачусетс США было организовано тестирование новорожденных на фенилкетонурию. Скрининг широко распространился в мире. В рамках многих программ было начато тестирование и на другие наследственные дефекты. В настоящее время программы неонатального скрининга охватывают от 8 до 50 наследственных нарушений обмена.

В России массовое обследование новорожденных на ФКУ начало проводиться с 1985г., на врожденный гипотиреоз с 1993г. С 2006г. внедрен скрининг на муковисцидоз, адреногенитальный синдром и галактоземию.

В Краснодарском крае массовое обследование новорожденных на НБО (ФКУ) проводится с 1987г. С 1994г. новорожденные обследовались на два заболевания (ФКУ, врожденный гипотиреоз), с 2006г. – на 5 (ФКУ, ВГ, муковисцидоз, адреногенитальный синдром, галактоземию). Уровень охвата скринингом новорожденных края с 1997г. стабильно превышает 99,0% (таблица 1).



Таблица 1

Результаты скрининга новорожденных на наследственные болезни обмена в Краснодарском крае за период с 1987-2007гг.

Наследственное заболевание обмена веществ

Обследовано новорожден-ных

Выявлено больных



Частота заболевания в КК

Частота заболевания в РФ (Новиков П.В., 2008)

фенилкетонурия

1 061 108 (92,4%)

111

1 : 8 376

1 : 7 697

врожденный гипотиреоз

680 786 (97,0%)

161

1 : 4 228

1 : 4 132

муковисцидоз

114 253 (99,7%)

10

1 : 11 425

1 : 11 585

адреногенитальный синдром

114 253 (99,7%)

15

1 : 7 617

1 : 8 662

галактоземия

116 041 (99,2%)

6

1 : 19 340

1 : 32 692

В организации неонатального скрининга в крае можно выделить несколько основных этапов, связанных с развитием медико-генетической службы:


1980 г.

Проведение селективного скрининга на фенилкетонурию среди контингентов повышенного риска с момента организации медико-генетической службы на Кубани.

1983 г.

Организация пилотного скрининга новорожденных на ФКУ в шести административных территориях края.

1987 г.

Организация неонатального скрининга на ФКУ на всей территории края.

1994 г.

Внедрение неонатального скрининга на врожденный гипотиреоз на базе существовавшего скрининга на ФКУ.

1997 г.

Разработка и внедрение компьютерной программы «Неонатальный скрининг».

2003 г.

Внедрение молекулярно-генетических методов диагностики фенилкетонурии.

2006 г.

Организация скрининга новорожденных на муковисцидоз, адреногенитальный синдром, галактоземию. Внедрение молекулярно-генетических методов диагностики муковисцидоза. Разработка и внедрение программного комплекса «Неоскрин».


По мере развития медико-генетической службы, внедрения новых технологий, более точных методов диагностики и лечения наследственной патологии, совершенствовались организация и алгоритмы проведения скрининга.

Расширение программы скрининга до пяти наследственных болезней обмена, необходимость диагностики адреногенитального синдрома и галактоземии до 10-12-го дней жизни детей обусловили разработку нового алгоритма (рис.1), в результате перехода на который мы добились стабильного забора крови на тест-бланки во всех родильных домах на 4-й день жизни, поступления бланков с кровью в МГК в среднем на 7-й день жизни, сообщения результатов первичного обследования новорожденных в ЛПУ края по электронной почте в среднем на 9-й день жизни.



Внесение информации о новорожденном в компьютерную программу «Регистрация новорожденных в родильном доме», формирование файла «Список новорожденных»


0466122428252783.html
0466208332780738.html
0466380455636041.html
0466445826989457.html
0466503209503940.html